直接测量细胞运动
·将细胞运动与细胞增殖区分开
·沿着迁移前端分割并跟踪单个细胞
·表征伤口愈合过程中的形态、行为细胞表型
引言:
伤口愈合测定是一种体外测定集体细胞迁移的实验。该测定的基础是在融合的细胞层内通过划痕来移除黏附的细胞或者通过在接种过程中通过物理障碍来清除细胞，从而形成无细胞区域。一旦创建了无细胞区域，就可以通过活细胞成像来监测伤口愈合。以这种方式测量集体细胞迁移，可以重复出在癌症转移，胚胎形态发生和组织损伤等一系列生物过程中发生的细胞迁移。
LiveCyte系统可用于活细胞成像，并能对细胞群体和单个细胞行为进行分析。测量的无创性（无标记，低照明功率）确保细胞不受干扰，在长时间内细胞行为更大程度接近自然方式下。不需要图像拼合就能得到非常大的成像视野。高对比度图像质量是的能够对单细胞行为进行表征（形态参数和运动性）。与传统方法（例如明场，荧光和相差成像）相比，LiveCyte系统能提供更多的参数信息。
方法:
将MDA MB231细胞以5×10 5个细胞/ ml接种在Ibidi培养基 - 插入2孔培养皿（货号81176）中，通过物理障碍形成细胞间隙。接种后24小时，取出插入物，用空载作为对照（1％BSA \ HBSS），50μM溶血磷脂酸（LPA）处理细胞。 Phasefocus的LiveCyte系统用于对伤口进行延时成像，每10分钟进行一次成像总共48小时。用Cell Analysis Toolbox 软件对伤口面积进行分割和测量，并且能够计算出t1/2(即伤口面积减小一半所用时间)和Vmigration（细胞迁移率）。另外，还能通过对单个细胞进行分割和追踪收集其动力学和形态学的数据。
图1 - 使用Phasefocus CAT软件测量间隙闭合
a）在0,24和48小时以及对照和LPA处理的细胞中使用CAT软件（蓝色轮廓）划分的伤口间隙的代表性图像。
b）相对间隙面积
c）在整个延时拍摄中测量的相对干质量。
d）t1 / 2间隙闭合一半的时间
e）从GAP闭合计算的集体迁移。
间隙闭合率是伤口愈合测定中测量的最常见的指标。随后，可以计算出间隙闭合一半时的时间(t1 / 2)和Vmigration。LiveCyte系统用于精确测定48小时内间隙面积的变化（图1）。
1a）与对照组相比，加入50μMLPA导致伤口以更快的速率闭合（图1a，b），间隙闭合一半时（t1 / 2）的时间为21.4小时，Vmigration为5.3μm/小时（对照组（t1 / 2）41.9小时和Vmigration2.5μm/小时），图1d，e）然而，间隙面积的变化受细胞迁移和细胞增殖二者的影响。因此，重要的是解释由于细胞增殖而引起的任何变化。由于我们获得的图像可以定量，获得的图像的定量性质可以确定细胞的光学体积。检测随着时间的推移所有细胞的总光学体积进而可以得出细胞生长和增殖的速度。在该实验中，细胞在50μMLPA处理16小时后细胞增殖速率明显增加（图1c），这表明16小时后细胞迁移和增殖都对t1 / 2差距和Vmigration有影响。除了对集体迁移进行建模之外，Livecyte系统的附加功能使得能够直接测量伤口前端的单个细胞（图2a）。如此对细胞的的追踪能够揭示出50μM LPA处理后细胞平均迁移速率的增长和瞬时细胞迁移速度。LPA处理后实验组meandering index减少，揭示迁移行为也受到影响（图2b）。进一步对单个细胞进行多参数分析，例如定量形态参数，如细胞面积，厚度，球形度和长宽比。50μM LPA处理导致细胞厚度和球形度的增加，同时减少了长度/宽度比。
图2 - 先进单细胞的分割和跟踪功能a）伤口前缘细胞的代表性图像
使用Phasefocus CAT软件在48小时内进行分割和跟踪。b）
运动性和c）从跟踪细胞计算出的细胞平均形态学指标。
结论:
在此应用指南中，我们阐述了Phasefocus Livecyte 系统对伤口愈合测定中在成像和数据分析方面的优势。该检测的无创性能够保证在更长的时间区间进行成像因此能够得到一个更加准确的随着时间伤口闭合的计量。另外在集体细胞迁移方面，产生高对比度的图像定量能够在单细胞水平对多个参数分析，这种单细胞分析在收集细胞形态学方面的信息的同时可以直接计算细胞迁移，能够对在伤口愈合过程中单个细胞同时进行行为和形态学分析。
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