我们通常所说的Th1、Th2和Th17是指T辅助细胞(严格意义上是Th0细胞)在各种生理与病理条件下分化为Th1、Th2和Th17的能力。静息状态(即未受任何刺激，如人的正常生理状态)下，Th0分化为Th1、Th2和Th17的能力非常弱，所以外周血中仅含有极少量的Th1、Th2和Th17细胞，这时我们所能检测到的IFN-γ、IL-4、IL-17A也微乎其微。而当Th细胞受到外界因素，如刺激素，病原体等刺激，其中Th0即会向Th1、Th2或Th17大量分化，具体分化趋向取决于细胞因子的种类。此时，我们检测到的IFN-γ、IL-4或IL-17A也较多。实验中我们检测的Th1、Th2和Th17实际上是检测Th细胞对刺激素刺激的反应能力。

我们通常选用的刺激素为PMA(佛波酯)+ Ionomycin(离子霉素)。

其中PMA为PKC(蛋白激酶C)的激活物，PKC则可激活下游众多的蛋白激酶的磷酸化，形成级联反应，导致许多蛋白的表达，进而引起T细胞的活化。在细胞内，PKC可被DAG(二脂酰甘油)和Ca2+的共同作用而激活，因此在Ionomycin(Ca2+的转运剂，可将细胞器内的Ca2+转运至胞浆内)的参与下，T细胞内PKC可被进一步激活。可见，PMA与Ionomycin协同活化T细胞。

也有人选用其它刺激剂来活化T细胞，如CD3/CD28协同刺激，PHA刺激等。实验表明，PMA为广谱性刺激，即T细胞中的各亚群均会被PMA同等激活，而CD3/CD28协同刺激和PHA刺激，则是通过TCR受体的作用，仅对部分T细胞亚群有效。所以可根据实验的需要来选择刺激方式。

活化的T细胞可分泌多种细胞因子至细胞外，而流式细胞仪仅能检测细胞内的抗原，所以应阻断细胞因子分泌至细胞外。方法为破坏高尔基体(Golgi)，因细胞因子(即各种蛋白)在合成后需经高尔基体的加工和转运，才能到达细胞膜，然后通过高尔基体膜与细胞膜的融合作用将细胞因子分泌至细胞外。因此破坏高尔基体即可切断细胞因子的转运途径，干扰其分泌。我们通常选用的阻断剂为BFA或Monensin, 其中BFA的阻断效果优于Monensin, 但由于前者价格较昂贵，现实验中多用Monensin来替代BFA.

另外，实验过程中涉及到如何正确的选定Th(即T辅助细胞)的问题。Th细胞的表面标志为CD3+CD4+，而当用PMA刺激4小时时，会发现CD4+的细胞明显减少，甚至消失，这是因为PMA会诱发细胞表面CD4分子被内吞。所以通常的做法是用CD3和CD8反设CD4细胞，即CD3+CD8-的细胞被认为是CD3+CD4+的细胞。(注：PMA对小鼠CD4的影响很小，所以检测小鼠Th1/Th2/Th17时可用CD4直接设门)。

详细实验步骤：

1. 标本采集及制备

A. 血液标本

用肝素抗凝管采集静脉血(必须用肝素钠抗凝, 不可用肝素锂、EDTA 或枸橼酸钠)1-2ml，血液室温放置，8 小时内必须进行检测，否则需弃用。

B. PBMC(外周血单个核细胞)标本

1) 肝素抗凝管采集静脉血至少 2ml，采集后4 小时内使用；

2) 加入等体积的 HBSS(Hank 平衡盐缓冲液， pH7.2-7.4)稀释血液；

3) 取与稀释后血液等体积的淋巴细胞分层液(Ficoll 液)加入离心管中；

4) 将稀释血液小心地加到淋巴细胞分层液上，注意保持两者界面清晰；

5) 室温下，2000 r/min，离心20 分钟；

6) 用毛细吸管轻轻吸出单个核细胞层，加入含有5ml HBSS 的试管中，充分混匀；

7) 1500 r/min，离心10 分钟，弃上清后，再洗一次；

8) 弃上清，用 RPMI 1640(含10%热灭活FBS)重悬单个核细胞，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95％以上)；

9) 调节细胞浓度为 2 x 106 细胞/ml

2. 需要的试剂方案

Human Th1/Th2 四色方案

Mouse Th1/Th2 三色方案