经常会有介绍说，NHEJ介导的DNA双链断裂修复引入的indel长度和序列是完全随机。但Megan van Overbeek和其同事研究该事件时，发现Cas9介导DNA双链断裂的修复结果并不是随机的。下面我们详细来看一看这篇2016年发表在molecular cell上，题为“DNA Repair Profiling Reveals Nonrandom Outcomes at Cas9-Mediated Breaks”的文章。
CRISPR/Cas9 KO原理
作为细菌或者古细菌的适应性免疫系统，CRISPR-Cas的免疫过程包括三步：第一步，将外源的基因组DN**段整合进入自身的CIRSPR阵列，这段DN**段对应外源基因组上序列被称为protospacer，对应CRISPR阵列上的序列被称spacer。第二步，CRISPR阵列被转录成RNA，即pre-CRISPR RNA，随后被加工成成熟的CRISPR RNA（crRNA）。第三步为干预阶段，crRNA通过互补配对识别外源入侵病毒基因组上的protospacer，并指导Cas蛋白切割降解该基因组。
而CRISPR/Cas9基因编辑技术就是是利用第三步的RNA介导靶向DNA的切割。Cas9切割基因组，产生DNA双链断裂（ＤＳＢ）之后，细胞会启用ＤＮＡ损伤修复机制来对ＤＳＢ进行修复。当细胞选择同源重组介导的修复（ＨＤＲ）时，修复后的ＤＮＡ双链将与断裂前一致，即无错的修复方式。当细胞选择非同源末端连接（ＮＨＥＪ）或者微同源末端介导的连接（ＭＭＥＪ）时，将可能会产生小片段的插入或者缺失（ｉｎｄｅｌ），所以常规认为ＮＨＥＪ或者ＭＭＥＪ是一种易错的修复方式。在应对ＤＳＢ时，细胞内最主要的修复方式是ＮＨＥＪ（或者ＭＭＥＪ），ＨＤＲ仅占很小部分。且ＨＤＲ修复后的双链ＤＮＡ会继续被ｓｇＲＮＡ识别，从而被Ｃａｓ９切割。如果Ｃａｓ９导致的ＤＳＢ位点位于基因的ＣＤＳ区，当ＮＨＥＪ或者ＭＭＥＪ引入的ｉｎｄｅｌ的长度是非３的倍数时，就会导致后续蛋白翻译移码，从而达到靶基因ＫＯ的目的。
将靶向基因组特定位置的ｓｇＲＮＡ和Ｃａｓ９共同转染２９３Ｔ／ＨＣＴ１１６／Ｋ５６２细胞４８ｈ后，收集细胞的基因组ＤＮＡ，ＰＣＲ后进行二代测序，分析切割位置上下游５０ｂｐ内碱基的插入和缺失情况（图１.Ａ）。作者发现，在不同组的重复结果中，对于相同的ｓｇＲＮＡ测序反馈的ｉｎｄｅｌ的类型和比例高度一致。相同的ｓｇＲＮＡ，在不同的细胞中，占比最高的几类ｉｎｄｅｌ也高度一致，不过频率有差别。例如，相比于２９３Ｔ和Ｋ５６２细胞，ＨＣＴ１１６展现出更高比例的一个腺嘌呤的插入，而缺失１９ｂｐ片段的比例更低（图１.Ｂ），因此作者猜测，Cas9切割导致的DSB修复结果不是随机的。但具体是什么影响了修复结果？是sgRNA的序列（对应到基因组上为protospacer），还是protosapcer附近序列，即背景的影响呢？
图1.分析Cas９切割DNA后修复检测流程及结果展示
为了回答这个问题，作者设计了一系列可以同时靶向人类基因组多个位置的sgRNA，总共有22个sgRNA，每个sgRNA在基因组上有2~14个靶点，共计127个靶点。
再次按照图1的流程进行实验分析后，作者发现，很多相同靶点虽然背景序列不同，但是其修复的结果高度一致（每个靶点三次独立重复实验）。以其中的第15号sgRNA的结果为例（图2），该sgRNA在基因组上有7个靶点，所有靶点的修复结果都非常相似，主要是单个腺嘌呤的插入和一个碱基的缺失。
图2.第15号sgRNA介导Cas9切割靶点后修复结果展示
整体来看22个sgRNA，其修复结果在不同的基因背景下都非常接近（图3）。比如第6号sgRNA在基因组上有14个不同的靶点，第11号sgRNA在基因组上有10个不同的靶点，第22号sgrNA在基因组上有10个不同的靶点，其修复结果中不同类型（插入或者缺失，插入什么碱基，缺失什么位置多长片段）的比例都高度类似，说明Cas9切割产生的双链DNA断裂其修复结果是非随机且依赖protosapcer序列的（sgRNA靶向的序列），而与protospacer所在基因组上的背景序列无关。作者同时在K562中进行该验证，验证结果得出和293T细胞相同的实验结论。
图3. 在293T细胞中，22个sgRNA靶点修复结果展示
DNA双链断链的主要修复同路包括NHEJ，MMEJ，SSA和HDR；由于SSA（单链退火）会导致大片段的缺失，HR是一种无错的修复方式，所以目前观察到的修复结果主要是NHEJ或者MMEJ导致。为了研究这两种修复方式对于修复结果的影响，作者对比了添加NU7441对于修复产物比例的影响。NU7441是一种DNA PKcs的抑制剂，可以抑制NHEJ修复通路。在添加NU7441后，观察到1bp的插入和1-3bp的缺失比例明显降低（图4），这说明在Cas9导致的DNA双链断裂的修复过程中，NHEJ主要参与1bp的插入和1-3bp的缺失，4bp以上的缺失主要是MMEJ修复通路导致的（微同源序列参与的，MH）。
图4. 在细胞中添加DNA-PKcs抑制剂NU7441，抑制NHEJ后对比DNA修复结果变化
这篇文章向我们展示了一项非常有趣的研究结果，即Cas9导致的DNA双链断裂并不是被随机修复的，修复结果具有很强的靶点特异性。我们先看看这个结果给我们实验上的启示：如果认为DNA双链断裂修复过程是完全随机的，在确定靶点能够有效切割DNA后，使用混合克隆株直接验证wb的敲除效率一定会是有效的（2/3的移码概率）；但是由于修复结果具有很强的靶点特异性，如果其中大部分是缺失3bp或6bp这类不产生移码的突变，那么此时即使有编辑基因组，蛋白水平很可能没有差异。另外，特定靶点对应特定的修复结果，暗示我们可以寻找合适的方法直接预测DNA修复结果，这样我们就可以直接设计特定sgRNA产生我们预期碱基的插入或者片段缺失，且相对于传统的KI，其相率将高出非常多。
欢迎大家持续关注吉凯基因公众号，后续我们将继续和大家分享文章是如何预测DNA双链断裂的修复结果。
吉凯基因拥有丰富的sgRNA设计经验，完善的病毒包装生产体系，严格的质控标准，为广大科研工作者提供可靠的基因调控产品。同时吉凯基因的CRISPR-Cas9系列产品已获得MIT及哈佛大学在**上的联合授权，欢迎大家咨询订购。
【参考文献】
Megan van Overbeek et al. DNA Repair Profiling Reveals Nonrandom Outcomes at Cas9-Mediated Breaks. Mol Cell. 2016 Aug 18;63(4):633-646.